一、技术概述

实时荧光定量PCR（qPCR）探针法是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量技术。本实验采用TaqMan探针法，通过探针上的荧光报告基团与淬灭基团分离释放荧光信号，实时监测PCR扩增进程，结合标准曲线对目标基因进行绝对定量，精确计算样本中核酸的拷贝数或浓度。该方法适用于低丰度靶标检测及严格定量需求的研究，如病原体载量分析、转基因成分定量等。

二、实验目的

通过构建标准曲线，利用探针法qPCR技术对目标基因（如病毒基因组、转基因序列、特定基因表达产物等）进行绝对定量，提供拷贝数或浓度的精准数据，为临床诊断、基因表达分析、食品安全检测及药物研发提供关键依据。

三、实验流程

1、DNA抽提

取约10mg样品至冷冻研钵中，加入液氮研磨至粉末状，转移至1.5mL离心管中，加200 uL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。然后，严格按照“TIANamp Bacteria DNA Kit”说明书步骤进行提取，详见说明书附件。

最终洗脱体积均为50uL。

2、定量PCR检测

1）将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。

2）冰上配制下表中的反应液

成分 加入量 终浓度

Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2X） 5μL 1×

Forward Primer (10μM) 0.2μL 0.2 μM

Reverse Primer (10μM) 0.2μL 0.2 μM

Probe(10μM) 0.4μL 0.4 μM

ROX Reference Dye Ⅱ（50X） 0.1μL 0.5×

DNA 模板 4.1 μL

3）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

4）采用三步法程序进行反应：

循环数 步骤 温度 时间

1 预变性 95℃ 20s

40 变性 95℃ 3s

扩增 60℃ 30s

四、技术优势

高特异性：探针与靶序列特异性结合，避免非特异性扩增干扰

高灵敏度：可检测低至1拷贝/μL的靶标，适用于痕量样本

绝对定量：基于标准曲线提供精确拷贝数，数据可比性强

应用广泛：适用于血液、组织、细胞等多种样本类型

五、适用范围

1️⃣ 病原体载量检测（病毒、细菌、真菌）

2️⃣ 转基因生物（GMO）成分定量分析

3️⃣ 基因表达绝对定量（mRNA/miRNA）

4️⃣ 药物疗效评估（靶基因表达动态监测）

六、代表性实验

七、客户提供

1 细胞样品: ＞2×107；细胞培养上清≥1ml

动植物组织/细菌、真菌样品: ＞100mg（黄豆粒大小）；

血清、血浆、全血及其他体液样品: ＞200μl；

RNA/DNA/cDNA: v≥10μl，c≥50ng/μl

2 物种信息及基因信息

（注：组织样品需液氮速冻、保存于-80度，样品使用干冰寄送，避免污染和反复冻融）